Conception D Outils Chimiques Pour La D Tection Des Structures D Adn G Quadruplex
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Chapitre 6 - G-quadruplex : structure, détection et fonctions
Les G-quadruplex (G4), structures secondaires pouvant être adoptées par les acides nucléiques, jouent des rôles biologiques dans de nombreux processus cellulaires : maintenance des télomères, réplication cellulaire, réarrangements génomiques, réponse aux dommages de l’ADN, régulation transcriptionnelle. Par ailleurs, dans le génome humain, il existe une forte présence de séquences potentiellement capables de former des G4. Ces observations mènent à la question de comment ces séquences se forment in vivo, sont maintenues dans les génomes et comment elles évoluent. Mots-clés : structure 3D, G-Quadruplex, NGS, instabilité génétique, génomique, bioinformatique. DOI : 10.51926/ISTE.9119.ch6
Conception d'outils chimiques pour la détection des structures d'ADN G-quadruplex
Des structures secondaires d'acides nucléiques atypiques, les structures G-quadruplex, peuvent se former autour d'un cation (K+ ou Na+) dans les régions riches en guanines, grâce à une association de type Hoogsteen. La formation de ces structures est impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques, comme la réplication, la transcription ou l'épissage. Elles peuvent affecter l'architecture de l'ADN jusqu'au niveau de la chromatine et provoquer une instabilité importante, tant génétique qu'épigénétique. De nombreuses méthodes ont été développées afin de détecter ces structures in vivo et de comprendre leurs implications au niveau cellulaire. Cependant, le panel d'outils moléculaires disponible actuellement ne permet pas une exploration du génome complète et sélective. Nous avons souhaité développer des outils, capables de sonder efficacement un milieu biologique complexe à la recherche de structures G-quadruplex et d'évaluer le potentiel d'une stratégie thérapeutique anti-tumorale ciblant ces structures. Nous avons mis au point un panel de composés combinant des ligands d'ADN G-quadruplex (PDC, PhenDC3 et Métal-ttpy) avec une biotine et un groupement photoactivable, permettant la capture et l'extraction de structures G-quadruplex de milieux biologiques complexes. Les ligands ont été évalués grâce aux techniques de FID et de FRET-melting, et sélectionnés pour leur affinité mais aussi pour leur affinité pour l'ADN G-quadruplex, assurant un ciblage efficace. Il a également été possible de piéger directement une séquence G-quadruplex en utilisant un complexe de platine, formant un adduit métallique avec les bases de l'ADN. Grâce ce type de ligand d'ADN G-quadruplex, la liaison de coordination métallique joue le rôle de marqueur covalent. Nous avons déterminé sur gel d'électrophorèse la localisation des adduits formés par des complexes dérivés du tolylterpyridine-platine (Pt-ttpy) et étudié la cinétique de platination de l'ADN G-quadruplex. La fonctionnalisation du complexe Pt-ttpy par des groupements photoactivables a permis de réaliser un double-ancrage covalent dans une structure d'ADN G-quadruplex. Par ailleurs, la fonctionnalisation avec un fluorophore a conduit aux premières évaluations en milieu cellulaire.Enfin, notre panel de composés a été testé dans des conditions de capture supportée d'ADN G-quadruplex. Une mise au point de la technique de capture a été réalisée en utilisant des billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Les expériences de capture sur billes ont montré que l'efficacité de nos outils varie en fonction de la topologie de la structure G-quadruplex ciblée et du ligand utilisé. Par ailleurs, le groupement photoactivable introduit sur certains de ces outils n'a pas permis d'améliorer la capture d'ADN G-quadruplex. Cependant, il a été possible d'utiliser ces outils en présence d'ADN génomique pour capturer efficacement de fragments d'ADN télomérique, par effet G-quadruplex.
Fonction et évolution des séquences répétées dans les génomes
Le génome des êtres vivants est composé de séquences d’ADN d’origines diverses, dont le rôle est parfois difficile à appréhender. Au-delà des gènes, dont le produit a une fonction biologique pouvant être inférée par l’expérimentation, certaines séquences, présentes en un grand nombre de copies, échappent encore aux approches les plus fines visant à élucider leur rôle précis. L’existence de ce que les généticiens du XXe siècle avaient déjà perçu, et décrit à tort comme de « l’ADN poubelle », fut confirmé par le séquençage des premiers génomes complexes, dont celui d’Homo sapiens. Une large partie de ce qui définit le vivant n’est pas unique mais répété, parfois un très grand nombre de fois, augmentant la complexité par duplication et multiplication successives. Comprendre et définir les nombreuses fonctions de cette myriade de séquences répétées, ainsi que leur évolution sous l’effet de la sélection naturelle et de la dérive génétique, est devenue l’un des enjeux majeurs de la génomique du XXIe siècle.