Target Oriented Bioprocess Optimization For Recombinant Protein Production In Bacillus Megaterium
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Target‐oriented Bioprocess Optimization for Recombinant Protein Production in Bacillus megaterium
The aim of this project was the development and targeted optimization of recombinant protein production with Bacillus megaterium. Based on a genetically defined model strain with plasmid based production of the gene for the green fluorescent protein (GFP), at first, the optimization of the basic culture parameters pH-value, temperature and dissolved oxygen concentration was performed. Further empirical analysis included an evaluation of different carbon sources and vitamin requirements. The use of GFP hereby enabled fast and simple detection of the production performance. Subsequently, recombinant protein production was also assessed on the cellular level – using system wide transcriptome and proteome analysis. Then, this was transferred to production processes at industrial scale, investigating limiting effects occurring in large scale bioreactors, i.e. heterogeneities in oxygen and substrate supply. Initially, a two compartment scale-down plant was developed for this purpose. Suboptimal feeding of the substrate induced extensive substrate- and oxygen gradients which had a negative effect on the GFP yield. With the help of advanced scale-down experiments, the metabolic origin of this detrimental production was investigated. In highly resolved time intervals the availability of free intracellular amino acids in B. megaterium was analyzed. Five strongly limiting amino acids were identified. In a subsequent large scale production the addition of these amino acids to the feed solution resulted in a 100 % increased GFP yield. Finally, the results from the model strain were successfully transferred to the production of a homologous protein, the levansucrase SacB. This enzyme is an important biocatalyst in the food industry for the production of prebiotic ingredients. In high cell density cultivations, a high product level, which was significantly higher than that of any other extracellular proteins, produced so far with B. megaterium, could be obtained. Hereby, the process allowed the use of raw glycerol, a waste product from biodiesel industry, as raw material for high titer and quality of the recombinant product.
Numerical Characterization of Mechanical Stress and Flow Patterns in Stirred Tank Bioreactors
Author: Manely Eslahpazir Esfandabadi
language: en
Publisher: Cuvillier Verlag
Release Date: 2013-06-24
Das Ziel der Arbeit bestand darin, die lokalen und globalen mechanischen Beanspruchungsparameter in einem Rührkesselbioreaktor mit Hilfe der numerischen Strömungssimulation (CFD) nachzubilden und die Ergebnisse mit experimentellen Daten der Pellet-kultivierung bzgl. Fluiddynamik und Rheolgie des rekombinanten Stammes A. niger SKAn1015 zu validieren. Ausgehend von der einphasigen Strömungssimulation eines 2L-Bioreaktors werden zunächst Simultionsdaten über Strömungsgeschwindigkeit und mechanische Beanspruchung diskutiert. Aßerdem erfolgt eine Validierung der einphasigen Simulationsdaten mit der Particle Image Velocimetry. In weiteren Untersuchungen wird die Strömungssimulation auch auf nicht-newtonsche Flüssigkeiten, so wie sie bei der Kultivierung filamentöser Pilze üblicherweise auftreten, mit dem Ostwald - de Waele-Ansatz erweitert und die mechanische Beanspruchung in Abhängigkeit zu den rheologischen Prozessparametern korreliert. Die Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher Rührergeometrien auf die Strömungsfelder und die mechanische Beanspruchung mittels CFD bildet den Abschluss, so dass die Auswahl eines geeigneten Rührers für den Kultivierungsprozess mit schesensitiven biologischen Systemen eindeutig getroffen wird. Die Arbeit validiert die numerische Strömungssimulation in einem Bioreaktor mit experimentell gnerierten biologischen und fluiddynamischen Prozessdaten und gibt praktische Hinweise darüber, wie biotechnologische Prozesse mit filamentösen Mikroorganismen hinsichtlich der Minimierung der mechanischen Beanspruchung zu betreiben sind.
Prozesstechnik und reaktionskinetische Analysen in einem mehrphasigen Mikrobioreaktorsystem
Mikrobioreaktoren stellen vielversprechende Werkzeuge für das Screening, die Entwicklung und das Scale-up von Kultivierungs- und biokatalytischen Prozessen dar, indem sie kostengünstige, flexible und informationsreiche Analysen unter gut kontrollierbaren Umgebungsbedingungen bieten. Eine erhöhte Rückvermischung und aktive Sauerstoffversorgung kann im Mikromaßstab durch das Konzept eines mehrphasigen Mikrobioreaktorsystems erzielt werden, welches in der vorliegenden Arbeit vorgestellt und verfahrenstechnisch charakterisiert wird. Die Anwendbarkeit des Mikrosystems für aerobe, submerse Prozesse wird durch die batch- und kontinuierliche Kultivierung des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae validiert. Anhand der experimentell bestimmten, stationären Daten für die Biomasse-, Glucose- und Ethanolkonzentration werden kinetische Parameter ermittelt, die eine Modellierung der ablaufenden, reaktionskinetischen Prozesse und damit den Vergleich zum Labormaßstab erlauben. Zusätzlich werden optische, bienzymatische Mikrosensorsysteme für die on-chip-Analyse von Glucose und Ethanol vorgestellt, die zusammen mit dem mehrphasigen Mikrobioreaktorsystem die Grundlage für die zukünftige Entwicklung eines vollständigen und parallelisierbaren Lab-on-a-chip-Systems bilden.