Luminescence Resolue Dans Le Temps D Ions Terbium Comme Methode D Investigation De La Dynamique Interne Et De La Structure Des Proteines

LUMINESCENCE RESOLUE DANS LE TEMPS D'IONS TERBIUM COMME METHODE D'INVESTIGATION DE LA DYNAMIQUE INTERNE ET DE LA STRUCTURE DES PROTEINES

CETTE THESE A EU POUR DOUBLE OBJECTIF DE VERIFIER DANS QUELLE MESURE LE DECLIN RESOLU DANS LE TEMPS DE LA LUMINESCENCE D'IONS TERBIUM POURRAIT PERMETTRE L'ETUDE DES FLUCTUATIONS CONFORMATIONNELLES DE PROTEINES ET DE TENTER DE LEVER, PAR L'OBSERVATION DIRECTE EN TEMPS REEL DU TRANSFERT D'ENERGIE AMINOACIDE AROMATIQUE-TERBIUM, LES INCERTITUDES QUI PESAIENT SUR LA NATURE DE SON MECANISME. A CETTE FIN, NOUS AVONS ETUDIE TROIS PROTEINES POSSEDANT UN SITE CALCIUM SUBSTITUABLE PAR UN ION TERBIUM: LA CALMODULINE, L'ELASTASE PANCREATIQUE ET LA THERMOLYSINE. LA PREMIERE CONCLUSION QUI RESSORT DE CETTE ETUDE EST LA FAIBLE SENSIBILITE DE LA DUREE DE VIE DE LA LUMINESCENCE INTRINSEQUE DES SONDES TERBIUM AUX VARIATIONS D'ENVIRONNEMENT, CONTRAIREMENT AUX ESPOIRS SUSCITES PAR DES TRAVAUX PUBLIES DONT ON MONTRE QU'ILS REPOSENT SUR DES INTERPRETATIONS ERRONEES. CE TRAVAIL PRESENTE, EN SECOND LIEU, LES PREMIERES OBSERVATIONS DE TRANSFERT D'ENERGIE INTRAPROTEIQUE ACIDE AMINE AROMATIQUE-TERBIUM RESOLU DANS LE TEMPS. LA LENTEUR DES PROCESSUS OBSERVES, QUI SE SITUENT DANS UN DOMAINE ALLANT DE QUELQUES DIZAINES DE MICROSECONDES A QUELQUES MILLISECONDES, INDIQUE QUE C'EST L'ETAT PREMIER TRIPLET EXCITE D'UN AMINOACIDE AROMATIQUE DONNEUR QUI EST IMPLIQUE DANS LE TRANSFERT. CES RESULTATS REMETTENT EN CAUSE L'HYPOTHESE IMPLICITE, FAITE POUR TOUTES LES DETERMINATIONS DE DISTANCE, D'UN TRANSFERT DE TYPE FORSTER SE PRODUISANT EXCLUSIVEMENT DEPUIS L'ETAT EXCITE SINGULET DU DONNEUR. EN RAISON DE LA TRES GRANDE SENSIBILITE DE TOUS LES MECANISMES DE TRANSFERT D'ENERGIE A LA DISTANCE DONNEUR-ACCEPTEUR, L'ETUDE DE LA LUMINESCENCE SENSIBILISEE RESOLUE DANS LE TEMPS S'EST AVEREE CONSTITUER UN OUTIL SENSIBLE A DES CHANGEMENTS CONFORMATIONNELS PROTEIQUES LOCAUX

Inventaire des thèses de doctorat soutenues devant les universités françaises

Etude par fluorescence résolue en temps de la dynamique conformationnelle des proteines

La fluorescence résolue en temps apporte différentes informations sur la structure et la dynamique interne des protéines en solution. Après quelques rappels fondamentaux, nous présentons l'état actuel des connaissances sur la spectroscopie du tryptophane, le principal chromophore des protéines. Une étude limitée du coenzyme NADH, réalisée comme première utilisation mondiale d'un laser à électrons libres sur anneau de stockage, permet ensuite une introduction méthodologique. La thioredoxine d'escherichia coli est une petite protéine de transport redox possédant un pont disulfure expose et très réactif. L'étude de la fluorescence de ses deux résidus tryptophane a constitué l'une des premières applications de la méthode d'analyse par maximisation d'entropie. Cette fluorescence, comme celle de nombreuses protéines étudiées ultérieurement, apparait constituée d'un petit nombre de composantes discrètes en échange lent par rapport à la nanoseconde, qui résulteraient principalement des équilibres acide-base et des équilibres conformation els internes de la protéine. La haute résolution des données a permis de suivre ces espèces avec précision, en fonction de la température et de l'état redox de la protéine. Nous avons ensuite étudié la fluorescence du résidu tryptophane unique situe dans la boucle active respective de toxines de venin de serpent, telles que la cardiotoxine de naja nigricollis et l'erabutoxine de laticauda semifasciata. Un formalisme d'analyse spécifique est proposé pour quantifier l'autoassociation de la cardiotoxine en solution. Dans le cas de la cardiotoxine monomérique, des hétérogénéités de fluorescence tres importantes sont observées à température ambiante, qui semblent associées à des échanges intermédiaires nanoseconde, et sont accompagnées de flexibilités limitées, mais significatives, de la chaine laterale du tryptophane. La boucle active de l'erabutoxine présente au contraire une très grande rigidité locale, a toutes les échelles de temps supérieures a la picoseconde. Ces différentes propriétés dynamiques pourraient avoir des implications dans les mécanismes d'action respectifs des cardiotoxines et des neurotoxines