Fonctions De Nouveaux Arn Non Codant Dans La R Gulation De L Expression Des G Nes Chez Staphylococcus Aureus
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Fonctions de nouveaux ARN non codant dans la régulation de l'expression des gènes chez Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus, pathogène opportuniste de l'homme, est responsable de 30% des infections nosocomiales. L'apparition de souches multi résistantes aux antibiotiques en font un problème majeur de santé publique. La pathogénie de la bactérie résulte de l'expression d'une pléthore de facteurs de virulence, mais quels sont les mécanismes de régulation contrôlant l'expression de ces gènes ? Aujourd'hui, il est clairement établi que les ARN non-codant sont des molécules clés dans la régulation de l'expression des gènes. Plus de 50 ARN ont été identifiés chez S. aureus. Néanmoins la fonction de peu d'entre eux est connue. Durant ce travail de thèse, l'étude de la fonction et du mécanisme de régulation des ARN RsaA et RsaE a été entreprise. RsaA est un ARN sous le contrôle du facteur de stress sigmaB. Les résultats obtenus montrent que ce dernier régule la traduction de l'ARNm mgrA qui code pour un facteur de transcription important dans l'expression des gènes de virulence et la régulation de l'autolyse. Par appariement de base, RsaA cible l'ARNm en utilisant deux sites distants et coopératifs, permettant un interaction forte qui empêche la traduction de l'ARNm. In vivo, la délétion du gène rsaA perturbe la synthèse de biofilm de capsule. En régulant la traduction de sa cible, RsaA permet de relier l'adaptation au stress à l'expression des gènes de virulence. De manière plus générale, les réseaux de régulation des ARN se connectent les uns aux autres pour permettre à la bactérie d'intégrer une multitude de signaux provenant du milieu extracellulaire afin de moduler finement l'expression des gènes.
Fonctions et mécanismes d'action de l'ARNIII et de nouveaux ARN non codants de Staphylococcus aureus
Il est maintenant bien établi que l'ARN est un des acteurs clés de la régulation de l'expression des gènes dans tous les organismes vivants. Chez les bactéries, plus de 10% du génome est suspecté coder pour des ARN régulateurs. Alors que dans les bactéries Gram-négatif, plus de 80 ARN ont été identifiés et que plusieurs d’entre eux régulent divers processus adaptatifs (changement de l’environnement, stress, virulence), peu de données existaient dans les bactéries Gram-positif au début de ma thèse. L’objectif de mon projet a été de caractériser et d’analyser la fonction et les mécanismes d’action de nouveaux ARN dans la bactérie pathogène Staphylococcus aureus. Staphylococcus aureus produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont finement régulés par l‘intervention coordonnée de protéines et d’ARN. Ainsi, l'ARNIII qui est induit en réponse à la densité cellulaire, était connu pour réguler l’expression de plus de 40 gènes de virulence. Par l’utilisation combinée d’approches expérimentales complémentaires, nous avons montré que l’ARNIII agit principalement comme ARN antisens en se fixant à de multiples ARNm codant pour une famille de facteurs de virulence et pour la protéine de régulation de la transcription Rot. Dans tous les cas, l’ARNIII utilise un motif conservé riche en cytosines pour interagir avec ses ARNm. Selon la structure de l’ARNm, les complexes générés adoptent des topologies variées (duplex irrégulier, interaction boucle-boucle). Ces complexes stables empêchent la formation du complexe d’initiation de la traduction et génèrent des sites spécifiques pour l’endoribonucléase III (RNase III) qui initie la dégradation des ARNm réprimés. L’ARNIII et la RNase III agissent de manière coordonnée pour réprimer de manière irréversible la synthèse des facteurs de virulence. Par ailleurs, en réprimant la traduction de l’ARNm rot qui code pour un répresseur des exotoxines, l’ARNIII régule de manière indirecte l’expression de nombreux autres gènes. L'ensemble de nos données a permis d’intégrer l’ARNIII dans un réseau de régulation complexe de la virulence. Dans le but d'élargir ce réseau, nous sommes ensuite partis à la recherche de nouveaux ARN non-codants (ARNnc). Une approche de génomique comparative des régions intergéniques incluant différents outils bioinformatique et l’analyse de leur expression nous ont conduit à l’identification de 11 nouveaux ARNnc (RsaA-K) de S. aureus. Alors que ces ARN sont tous stables et majoritairement exprimés en phase stationnaire, leurs tailles et leurs degré de conservation sont différents. Leur expression est régulée en réponse à divers stress et par différents régulateurs de la transcription, comme le facteur Sigma B. Bien que la fonction de la plupart de ces ARN reste encore à déterminer, nous avons montré que RsaE réprime la synthèse de plusieurs protéines impliquées dans diverses voies métaboliques. La plupart de ces ARN possèdent le même motif riche en C que l'ARNIII, indiquant l'existence d'une classe d'ARNnc qui agirait par un mécanisme commun sur leurs gènes cibles. Toutes nos données permettent d’ores et déjà d’appréhender les réseaux de régulation dans lesquels ces ARN sont impliqués et suggèrent des connections possibles entre le métabolisme, la réponse au stress et la virulence de S. aureus.
Étude structurale et fonctionnelle d'ARN non codants exprimés chez Staphylococcus aureus
Les ARN non codants (ARNnc) sont des ARN qui ne sont généralement pas traduits en protéine. Ils sont impliqués dans la régulation de processus physiologiques variés tels que la réplication, la transcription et la traduction et parfois dans la virulence bactérienne. Ils sont classés en deux groupes selon leur mode d’action : (i) les ARN agissant par appariement à un ou plusieurs ARNm cibles et qui font intervenir, chez Escherichia coli (E. coli), un partenaire protéique appelé Hfq ; (ii) les ARN régulant l’activité de protéines cibles. Staphylococcus aureus (S. aureus) est une bactérie commensale responsable de vingt pour cent des infections nosocomiales en France. Il occasionne des infections superficielles mais aussi plus profondes. L’expression de sa virulence est régulée par un ARN, l’ARNIII. Au laboratoire, un précédent travail a abouti à l’identification de sept nouveaux ARNnc exprimés chez S. aureus. Dans un premier temps, nous avons montré par des expériences de retard sur gel, Northern Blot et biopuces que la protéine Hfq a un rôle limité dans les relations ARNnc/ARNm chez S. aureus comparé à E. coli. Ensuite, nous avons étudié de manière structurale et fonctionnelle l’un de ces nouveaux ARNnc : SprA (Small pathogenicity island RNA). Des expériences de digestions montrent l’existence de deux pseudonoeuds centraux. SprA est fortement structuré ce qui est compatible avec son appartenance à la deuxième classe. Nous avons également mis au point les outils génétiques permettant l’étude la fonction de SprA : (i) une souche surexprimant cet ARNnc (ii) ainsi qu’une souche de délétion. L’étude des phénotypes engendrés par les variations d’expression de SprA est en cours.